使用點成LUNA-FX7™自動細胞計數儀計數原生質體：熒光染料組合

關鍵詞：自動細胞計數、原生質體分離、原生質體活性評估、雙重染色、染料評估

1 引言

原生質體是通過酶解或機械方法去除細胞壁的植物細胞。這些無細胞壁的球形植物細胞具有獨特特性，使其成為植物科學研究的多功能工具。它們可作為實驗系統可用于探索植物細胞的結構、化學特性及功能。

傳統活力評估需將原生質體培養至發育成完整植株，但該方法無法實現即時的活力評估。點成LUNA-FX7™自動細胞計數儀用不同顏色的熒光染料，通過雙重染色法快速測定活力，但需了解該設備在不同染料條件下的表現并調整分析參數。本研究旨在確定使用點成LUNA-FX7™自動細胞計數儀評估原生質體活力的染料組合及參數設置。

2 原生質體分離與染色

2.1 原生質體分離步驟

1. 準備5克幼苗，依次用乙醇和蒸餾水各清洗1次和2次。

2. 用紙巾吸干水分后置于培養皿中，用剪刀細切。

3. 加入25ml消化緩沖液混勻，轉移至50ml離心管并用錫箔紙遮蓋避光。

4. 置于搖床上以20轉/每分鐘轉速培養6小時。

5. 培養后加入20ml洗滌緩沖液，輕輕混勻后經100 μm濾網過濾。

6. 100 g離心3分鐘。

7. 去除上清液，加20ml洗滌緩沖液混勻后經40 μm濾網過濾。

8. 再次100 g離心3分鐘。

9. 去除上清液，用3ml洗滌緩沖液重懸沉淀。

2.2 熒光染色步驟

1. 混合：

l18 μL原生質體細胞

l2 μL綠/紅熒光染料等體積混合液

2. 取10 μL染色細胞懸液樣本上樣

3. 使用點成LUNA-FX7™進行分析。

* 注意：原生質體尺寸差異大，可能表現出不同的熒光強度。請根據需要進行調整。

表1：點成LUNA-FX7™熒光細胞計數模式下原生質體計數的建議參數

3 用于活性測定的熒光染料

我們選用了五種常用熒光染料進行活力評估：

4 原生質體活力評估的熒光染料組合

FDA/PI或FDA/EthD-1是原生質體活力評估的選擇（圖1）。PI和EthD-1均能有效染色原生質體核，但需要將紅光曝光水平調至9才能檢測到充足信號（表1）。

在測試的綠色熒光染料中，僅FDA無需調整綠光曝光水平即可產生明亮可靠的信號。FDA和Calcein AM雖均依賴酯酶活性產生信號，但Calcein AM幾乎無信號響應。需特別注意的是，FDA在持久培養時間中可能產生較高的背景噪音，建議在染色后立即進行細胞計數，以獲得活力評估結果。如果信號過強，可以通過調整綠光曝光水平進行優化。此外，盡管AO通常被認為能染色所有細胞，但其熒光強度顯著降低。

圖 1：分離原生質體的染色結果。原生質體經FDA/PI或FDA/EthD-1染色效果較好，而AO/PI或EthD-1、Calcein AM/PI或EthD-1均未顯示綠色信號。

FL：綠色和紅色熒光通道合并圖像。

Tag：所有通道（熒光和明場）合成圖像，檢測目標以紅/綠圈標記，紅圈表示死細胞，綠圈表示活細胞。

5 緩沖液對綠色熒光染料性能的影響

盡管AO能夠染色所有細胞（無論死活），但其在原生質體中低信號異常促使我們進一步研究。我們在哺乳動物細胞（如U937細胞）上使用綠色染料進行實驗，并使用PBS或洗滌培養基作為緩沖液，采用默認分析方案評估緩沖液對染料信號的影響。結果顯示：AO信號強度在洗滌緩沖液中較PBS顯著降低（圖2A）；Calcein AM在洗滌緩沖液中信號穩定性提升，FDA信號受緩沖液類型影響較小，僅強度輕微下降（圖2B和圖2C）

導致這些差異的具體因素尚不明確，但緩沖液的滲透壓和pH值差異可能會影響細胞狀態和染料性能。例如，AO在不同pH值下可能顯示不同顏色。而滲透壓的差異會使細胞大小從13 µm左右縮小至1-2 µm。綜合考慮這些因素，化學條件的變化可能通過多種機制影響染料表現。

圖2 不同緩沖液對AO（A）、Calcein AM（B）及FDA（C）在U937細胞中染色性能的影響。AO信號在洗滌培養基中減弱，Calcein AM性能改善，FDA則無明顯變化。

BF：明場圖像

FL-Tag：熒光通道合并圖像，檢測目標以紅/綠圈標記。紅色圓圈表示死細胞，綠色圓圈表示活細胞。

6 結論

FDA/PI或DA/EthD-1是原生質體染色活力評估組合。FDA始終產生可靠的信號，但應在染色后立即進行細胞計數，以盡量減少培養期間的噪音。Calcein AM的性能因細胞類型和緩沖液而異。值得注意的是，AO信號在洗滌培養基中顯著降低。此外，PI和EthD-1對原生質體的染色效果良好，但需將紅光曝光水平從5調至9。總之，點成LUNA-FX7™自動細胞計數儀通過優化染料組合與分析參數，可為原生質體活力評估提供高效解決方案。