利用點成LUNA-FX7™自動細胞計數儀優化精子細胞評估

關鍵詞： 自動細胞計數儀、基于圖像的精子細胞評估、細胞計數、存活率評估、雙重染色

1 引言

       精子細胞評估（又稱精液分析），在判斷男性生育潛力方面發揮著重要作用。雖然它并非直接衡量生育能力的指標，但男性生育能力對人類生育和畜牧業育種均具有重要影響，因此精子細胞評估備受關注。

       目前，可通過流式細胞術和基于圖像的分析工具進行精子細胞評估。點成LUNA-FX7™自動細胞計數儀等自動化設備可利用圖像快速、便捷地分析精子樣本。然而，由于精子細胞相較于哺乳動物細胞在形態和特性上的獨特性，因此需要優化分析參數并選擇合適的染料。

本研究對SYBR14、吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）等熒光染料進行了比較分析，以優化點成LUNA-FX7™對精子細胞的評估能力。本研究旨在評估不同染料組合的有效性，并優化精子細胞評估的參數設置。

2 方法與材料

2.1 樣本制備

       解凍牛的冷凍精液樣本，并用PBS替換緩沖液。根據樣本情況，將精液樣本以約1:20至1:40的比例稀釋于PBS中。

2.2 熒光染色

1. 混合：

     18 μL PBS中的精子細胞

       2 μL混合的綠色和紅色熒光染料

2. 在37℃孵育10分鐘

3. 將樣本加載至合適的載玻片

4. 使用點成LUNA-FX7™進行分析

表1. 點成LUNA-FX7™高級模式下精子細胞評估的優化參數設置

3 優化精子細胞評估的細胞計數方案和染料組合

總結：SYBR14/PI 與 AO/PI 雙重染色均適用于精子活力評估，但 SYBR14/PI 表現更優。

        點成LUNA-FX7™的默認協議已針對常見哺乳動物細胞優化，但精子細胞評估需要調整曝光水平、細胞尺寸和去團聚靈敏度等參數。例如，將最小搜索尺寸從3 µm調整為7 µm，并將去團聚靈敏度從5調整為7，以提高檢測性能（表1）。此外，SYBR14/PI和AO/PI染色的曝光水平分別設定為GF 6和RF 9。

        在此基礎上，我們對SYBR14/PI和AO/PI染色方法進行了比較分析。鑒于SYBR14/PI染色法在精子細胞評估中的已知有效性，我們關注AO/PI染色法的表現。研究結果表明，兩種染色方法均可用于精子細胞評估（圖1）。然而，SYBR14在精子細胞染色中的適用性優于AO，表明SYBR14的化學特性可能更適合這一應用。

圖1. 用兩種不同染料（SYBR14/PI和AO/PI）染色的精子細胞的熒光圖像。該組合圖像展示了分析后的明場、綠光、紅光和標記圖像。標記圖像為復合熒光通道圖像，其中紅色圓圈表示死亡細胞，綠色圓圈表示存活細胞。

4 結論

       本研究發現，SYBR14/PI和AO/PI染色法均可用于評估精子細胞存活率，但SYBR14/PI的表現更優。此外，曝光水平及其他參數的調整對整體檢測性能至關重要。盡管點成LUNA-FX7™并非專門針對精子樣本優化，但通過推薦的樣本稀釋比例和成像條件優化，它仍可提供快速、便捷的精子細胞評估方案。